三、柱效參數(shù)

⑴理論塔板數(shù)（theoretical plate number,N）用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。
    N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對稱并符合正態(tài)分布，N可近似表示為：
N=（tR/σ）2=16（tR）2/W =5.54（tR/W1/2）2
W：峰寬 ； σ：曲線拐點處峰寬的一半，即峰高0.607處峰寬的一半。
N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組份含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。
    用半峰寬計算理論塔板數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更容易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。
N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應(yīng)注明柱長，，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用調(diào)整保留時間（tR’）計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)（N有效或Neff）=16（tR’/W）2

⑵理論塔板高度（theortical plate height,H）每單位柱長的方差。H=。實際應(yīng)用時往往用柱長L和理論塔板數(shù)計算：H=L/N

四、相平衡參數(shù)（distribution coefficient,K）
    在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。K=[xs]/[xm]
Cs-溶質(zhì)在固定相中的濃度 Cm－溶劑在流動相中的濃度
分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)（或稱交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。
    在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs 、Cm很小）時，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減少，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質(zhì)濃度的增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能較少進樣量，使組份在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。
    在同一色譜條件下，樣品中K值大的組份在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組份則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M份的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此，混合物中各組份的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。
    在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質(zhì)影響。實踐中主要靠調(diào)整流動相的組成配比及PH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。

1、容量因子（capacity factor,K）--化合物在兩相間達到平衡時，在固定相與流動相中的量之比。K＝（tR-t0）/t0=tR’/t0（或溶質(zhì)在固定相中的量/溶質(zhì)在流動相中的量）。因此，容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。
｛K=Cs/Cm=K’Vm/Vs k=（tR-t0）/t0=K*Vs/Vm Vs：色譜柱中固定相的體積； Vm：色譜柱中流動相的體積。｝
分配系數(shù)、容量因子與保留時間之間有如下關(guān)系：k===K=,tR’=kt0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組份在固定相中停留的時間（tR’）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k=0時，化合物全部存在與流動相中，在固定相中不保留，tR’=0;k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。
容量因子與分配系數(shù)的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于tR’、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。

2、選擇性因子（selectivity factor,α）--相鄰兩組份的分配系數(shù)或容量因子之比。α＝＝（設(shè)k2>k1）。因k=tR’/t0,則α＝k2/k1，所以α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。
要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，α的大小表示兩組份在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。

五、分離參數(shù)

1、分離度（resolution,R）--相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R=（tR2-tR1）/[（W1+W2）/2],當W1=W2時，R=。當R=1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露鋒面積為95.4％，內(nèi)測峰基重疊約2％。R=1.5時，稱為6σ分離，裸露鋒面積為99.7％。R≥1.5稱為*分離?！吨袊幍洹芬?guī)定R應(yīng)大于1.5。

2、基本分離方程――分離度與三個色譜基本參數(shù)有如下關(guān)系：
R=1/4（а-1）×N0.5×［k’/（1+k’）］
其中N稱為柱效項，α為柱選擇項，k’為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學(xué)特性有關(guān)，后兩項與色譜過程熱力學(xué)因素有關(guān)。
從基本分離方?？煽闯?，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R=0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a.改變流動相的組成及PH值；b.改變柱溫；c.改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的zui容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成來實現(xiàn)。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2 不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2 在1～10范圍內(nèi)，為2～5，窄徑柱可更小些。

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